(1)pcr实验体系
反应体积100μl。模板10μl。p10.5μl(10pmol/l),p20.5μl(10pmol/l)。4×。dntp4μl(4×。200mmol/l)。10×。缓冲液10μl,dmsd5μl,dw65μl,循环参数为94℃60s。60℃60s。72℃60s。循环40次72℃延伸4min。
(2)扩增产物检测与酶切分型
①第一步电泳鉴定取10μlpcr产物加4μl样品缓冲液,加入2%琼脂糖凝胶板,70v电泳(5-20min)加eb染色5min后,紫外灯下观察,可初步鉴定扩增产物大小。
②酶切分析分别取20μlpcr产物于2个eppendorf管中,加入50μl无水乙醇,-20℃沉淀dna,再分别用20μlsmal和bamhi反应缓冲液溶解,加入smai或bamhi50u于相应eppendorf管内,37℃作用1h。
③第二步电泳分型,取10μlpcr酶切物加4μl样品缓冲液,加到2%琼脂糖凝胶中,70v电泳,15-20min后,eb染色5min,与同步加入未酶切的pcr产物相对照。紫外灯下观察,结果如下